Validación de métodos analíticos: ¿son tus métodos analíticos adecuados para el uso previsto?

La especificidad es la capacidad del método para medir solo el analito de interés sin interferencia de otros componentes de la muestra que probablemente estén presentes, como impurezas, degradantes, componentes de la matriz, etc. Se puede evaluar mediante el análisis de muestras que contienen el analito de interés y las posibles sustancias interferentes.

Las pruebas utilizadas para demostrar la especificidad dependerán del uso previsto del procedimiento analítico; las pruebas de identificación adecuadas deben ser capaces de discriminar entre compuestos de estructuras estrechamente relacionadas, mientras que las pruebas de ensayo o de pureza adecuadas deben ser capaces de discriminar entre el analito, las impurezas, los productos de degradación y/o los componentes de la matriz.

                                                                                    Figura 1: Un ejemplo de especificidad del método (ref3).

El método analítico debe ser lineal, es decir, debe haber una relación directa entre la concentración del analito o analitos y la señal producida.

La linealidad generalmente se evalúa mediante el análisis de muestras que contienen el analito a 5 niveles de concentración diferentes por triplicado. A continuación, se crea un gráfico de señales en función de la concentración o el contenido del analito, normalmente mediante una línea de regresión. Se debe calcular el coeficiente de correlación, la intersección con el eje y, la pendiente de la línea de regresión y la suma residual de los cuadrados.

En caso de que un método analítico no demuestre linealidad, incluso después de cualquier transformación, la respuesta analítica debe describirse mediante una función apropiada de la concentración (cantidad) de un analito en una muestra.

                                                                                       Figura 2: Ejemplo de una recta de regresión (ref4).

                                                                                                   Figura 3: Gráfico de residuos (ref5).

La precisión es el grado de concordancia (grado de dispersión) entre mediciones repetidas de la misma muestra en las mismas condiciones.

Se mide calculando la desviación estándar (relativa) y el intervalo de confianza de las mediciones repetidas de múltiples muestreos de la misma muestra homogénea. Se definen tres niveles de precisión: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad.

Repetibilidad: precisión establecida en las mismas condiciones de funcionamiento durante un corto período de tiempo utilizando un mínimo de 6 determinaciones al 100% de la concentración de ensayo o 3 réplicas de 3 concentraciones.

Precisión intermedia: debe establecer los efectos de los eventos aleatorios en la precisión del procedimiento analítico calculado utilizando un mínimo de 6 determinaciones al 100% de la concentración de ensayo. Variaciones típicas dentro del laboratorio, como días, analistas, equipos, etc.

Reproducibilidad: diferentes analistas en diferentes laboratorios deben ser capaces de obtener resultados similares. 

                                                                                                Figura 4: Precisión vs Exactitud (ref6).

La precisión es la proximidad de los resultados de la prueba al valor verdadero o teórico. La precisión se evalúa utilizando un mínimo de 9 determinaciones en un mínimo de 3 niveles de concentración que cubren el rango especificado (por ejemplo, 3 replica cada una de las 3 concentraciones en el rango). A continuación, la precisión se informa como un porcentaje de recuperación de la cantidad teórica de analito en la muestra, junto con los intervalos de confianza.

El rango especificado se deriva normalmente de estudios de linealidad y depende de la aplicación prevista del procedimiento.

Se establece confirmando que el procedimiento analítico proporciona un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión cuando se aplica a muestras que contienen cantidades de analito dentro o en los extremos del rango especificado del procedimiento analítico.

                                                                                                          Figura 5: Rango (ref7).

• El límite de cuantificación (LOQ) es la cantidad más baja de un analito que se puede cuantificar con la exactitud y precisión adecuadas.
• El límite de detección (LOD) es la cantidad más baja de un analito que se puede detectar, pero no necesariamente cuantificar.

                                                                                                           Figure 6: LOQ vs LOD (ref 8).

• sobre la base de la evaluación visual,
• en función de la relación señal-ruido,
• o en función de la desviación estándar de la respuesta y la pendiente.

La evaluación de la robustez debe tenerse en cuenta durante la fase de desarrollo. Debe mostrar la fiabilidad de un análisis con respecto a las variaciones deliberadas en los parámetros del método.

Un parámetro importante es la estabilidad de la solución de muestra.

Las pruebas de idoneidad del sistema son una parte integral de muchos procedimientos analíticos. Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, la electrónica, las operaciones analíticas y las muestras constituyen un sistema integral que debe ser evaluado como tal. Todos los parámetros (calculados) están dentro de los límites aceptables, lo que indica un buen rendimiento del método y del sistema.