En los últimos 20 años, la industria farmacéutica ha desarrollado muchas terapias y tecnologías nuevas, como las proteínas recombinantes, la tecnología del ARNm y las terapias celulares de última generación. El Reglamento Europeo 1394/20071 introdujo el marco regulador de estos medicamentos de terapia avanzada (ATMP) en Europa y especificó 4 clases de productos :
- Medicamentos de terapia celular somática (sCTMP)
- Medicamentos de terapia génica (GTMP)
- Productos de ingeniería tisular (TEP)
- Combinación de medicamentos antirretrovirales
Una de las nuevas terapias celulares desarrolladas es la terapia celular con receptores de antígenos quiméricos o terapia celular CAR-T. Las células CAR-T pertenecen a la clase ATMP de «medicamentos deterapia génica», ya que su principio activo corresponde a células T modificadas genéticamente.
La modificación genética se obtiene insertando un transgén que codifica el CAR en el genoma de las células T. El resultado de esta modificación genética, la célula CAR-T, es responsable de la acción inmunológica.
El desarrollo de las terapias con células CAR-T comenzó a finales de la década de 19802 y, a pesar de la actual cartera de productos CAR-T y del gran número de ensayos clínicos en curso, sólo dos terapias autólogas con células CAR-T anti-CD19 han recibido la autorización de comercialización en Europa y Estados Unidos.
A saber:
- Kymriah ®, tisangenlecleucel (Novartis Europharm), aprobado para el tratamiento de pacientes pediátricos y jóvenes de hasta 25 años de edad con leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA) refractaria, en recaída tras el trasplante o en segunda o posterior recaída y para pacientes adultos con linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) después de dos o más líneas de tratamiento sistémico.
- Yescarta ®, axicabtagene ciloleucel (Kite Pharma), aprobado para pacientes adultos con LDC recidivante o refractario y linfoma mediastínico primario de células B grandes (LMBP), después de dos o más líneas de tratamiento sistémico.
Estas terapias se dirigen actualmente a los cánceres hematológicos (de la sangre). En esta entrada del blog, hablamos de:
- los principales componentes de la terapia celular CAR-T, es decir, las células T y los CAR,
- el marco regulador y la producción de esta terapia de células efectoras inmunitarias (CEI),
- y las perspectivas y desafíos futuros.
Células T: un componente importante de la terapia con células CAR-T
Sobre el origen de las células B y T
Las células T, también llamadas linfocitos T, son uno de los componentes más importantes del sistema inmunitario adaptativo, además de las células B.
Todos los elementos celulares de la sangre, como los glóbulos rojos, las plaquetas y los glóbulos blancos, se originan a partir de las mismas células precursoras (también llamadas células progenitoras), es decir, las células madre hematopoyéticas de la médula ósea. Estas células madre multipotentes pueden diferenciarse en células progenitoras mieloides y células progenitoras linfoides.
Monocitos (macrófagos en forma madura), células dendríticas Los granulocitos y los mastocitos se derivan de estas células progenitoras mieloides, por lo que estas células no se tratarán con más detalle en esta entrada del blog. El segundo grupo de células progenitoras -las células progenitoras linfoides- dan lugar a los linfocitos y a las células asesinas naturales ( Células NK ).
Hay dos tipos principales de linfocitos: Los linfocitos B (células B) y los linfocitos T (células T). Las células B maduran en la médula ósea, mientras que las células T migran al timo para madurar. Una vez madurados, los linfocitos T y B entran en el torrente sanguíneo y migran a los órganos linfoides periféricos (por ejemplo, los tejidos linfoides asociados a las mucosas, como el apéndice, los ganglios linfáticos y el bazo) para realizar sus tareas de respuesta inmunitaria adaptativa.
Estos diferentes linfocitos no pueden distinguirse en base a aspectos morfológicos, pero pueden clasificarse en base a sus receptores únicos, células T y células B, o la falta de un receptor específico en el caso de las células NK.
3 tipos específicos de células T
Los tipos específicos de células T obtenidos por leucaféresis (que se describirán más adelante) servirán como material de partida en el proceso de fabricación de CAR-T, como se explica más adelante. Se pueden distinguir tres subconjuntos principales de células T, a saber
Células T efectoras (Teff)
Las células T efectoras incluyen las células T citotóxicas (células T, también llamadas células CD8+) y las células T auxiliares (células Th, también llamadas células CD4+)
- Las células Th ayudarán a la respuesta inmune liberando citoquinas.
- Por otro lado, las células TC participan en la destrucción de las células infectadas por el virus y de las células tumorales.
Células T reguladoras (Treg)
Las células T reguladoras CD4+ y CD25+ desempeñan un papel crucial en el cese de la inmunidad mediada por células T y, por tanto, estas células son capaces de controlar y suprimir la respuesta inmunitaria.
Células T de memoria (Tm)
Células T específicas de antígeno que permanecen en el cuerpo después de la infección (memoria inmunológica).
De las células T ingenuas a las células T efectoras
Después de la maduración completa, la célula T ingenua (célula T inactivada) buscará antígenos extraños.
El receptor de antígenos de células T (TCR) presente en la membrana de la célula T reconoce péptidos derivados de proteínas o patógenos extraños, por ejemplo, células tumorales o células infectadas por virus, asociados a una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC).
Otros cuatro dominios de señalización -denominados colectivamente CD3- y las cadenas ζ, son necesarios para que la célula T sepa que el péptido está unido.
Figura 1 – Bases moleculares del reconocimiento del TCR-péptido MHC. El complejo TCR contiene las cadenas CD3ζ, CD3γ, CD3δ y CD3ε (fuente de referencia 3)
Dependiendo de la clase de MHC (I o II), se unirá un tipo diferente de célula T ingenua. Las células Tc (CD8+) reconocerán los antígenos en asociación con las moléculas MHC de clase I y las células Th están implicadas para las moléculas MHC de clase II (Figura 1).
Para la proliferación y diferenciación de los linfocitos T ingenuos en linfocitos T efectores (linfocitos T activados), se debe recibir una señal costimuladora inespecífica de la célula presentadora de antígeno (APC) además de la unión específica del TCR. De hecho, el CD28 de la célula T se une al CD80/CD86 de la APC (Figura 2).
Figura 2 – Ilustración de la activación de una célula T por la interacción entre las moléculas MHC de clase II de la célula presentadora del antígeno y el receptor de la célula T (TCR) y la señal coestimuladora del CD28 con el CD80/CD86. (Fuente: referencia 4)
Aunque las células T son muy eficaces, algunos patógenos o células malignas han encontrado formas de escapar a este reconocimiento de antígenos y, por tanto, pueden eludir el sistema de vigilancia de las células T del sistema inmunitario. Se inventaron nuevas tecnologías para superar esta barrera, a saber, la reingeniería de la célula T en una célula CAR-T para las terapias con células CAR-T.
CARs: reconocimiento de antígenos por ingeniería genética
¿Qué son los CAR?
CAR son las siglas de Chimeric Antigen Receptor (Receptor de Antígeno Químico), ya que está compuesto por varios dominios derivados de diferentes componentes a través de una manipulación ex-vivo de ingeniería, como los anticuerpos quiméricos (Ab) derivados de diferentes especies (por ejemplo, un anticuerpo combinado humano y de ratón).
En el caso de los CAR, el dominio de reconocimiento de antígeno se deriva de un Ab y el dominio de señalización de células T CD3ζ se deriva del TCR.
Figura 3 – El diseño de las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). El fragmento variable de cadena única (scFv) del CAR se deriva de las cadenas pesada y ligera de la región variable del anticuerpo, mientras que el dominio CD3ζ del CAR se deriva de los dominios de señalización intracelular del receptor de células T. (fuente de referencia 5)
4 dominios principales de CAR
Desde el desarrollo del primer CAR, se han creado varias generaciones nuevas para aumentar la persistencia, la actividad y la regulación de las células CAR-T. Los CAR suelen constar de 4 ámbitos principales con sus acciones específicas:
Figura 4 – Estructura de la CAR (fuente de referencia 7)
Dominio de unión a antígeno
Unión específica de las células T al antígeno diana de forma independiente del CMH.
Dominio de la bisagra
Facilita el acceso al objetivo Ag.
Dominio transmembrana
Anclaje del CAR en la membrana celular (influye en la estabilidad y función del CAR).
El(los) dominio(s) de señalización intracelular
Normalmente contiene el dominio de activación (CD3ζ) y uno (o más) dominios coestimuladores (CD28, 4-1BB, ….). Las diferentes generaciones de CARs se definen en función del diseño de sus dominios de señalización6.
Las terapias con células CAR-T actualmente aprobadas (Kymriah® y Yescarta®) contienen ambas CAR de segunda generación. Al convertir la célula T en una célula CAR-T, la propia célula T puede atacar células tumorales específicas y utilizar sus propios mecanismos inmunitarios de células T para destruir la célula.
Terapia celular CAR-T: proceso de fabricación desde el donante (muestra de sangre) hasta la administración (infusión)
Actualmente, sólo se ha autorizado la comercialización de dos CAR-T autólogas. Por lo tanto, se destacarán los aspectos clave del proceso de fabricación de una terapia autóloga.
La industria está desarrollando procesos de fabricación cerrados o semicerrados automatizados (por ejemplo Miltenyi CliniMACS Prodigy ) para reducir el riesgo de contaminación del producto y acelerar el tiempo entre la vena y la vena, es decir, reducir todo el tiempo de fabricación desde el punto de donación hasta la administración.
Figura 5 – Diagrama del proceso de tratamiento con células T CAR (fuente de referencia 8)
Paso 1: Leucoféresis
La donación, la obtención y la comprobación de las células para los ATMP deben realizarse de acuerdo con la Directiva sobre tejidos humanos 2004/23/CE9 (Reg1394/2007 (14)).
Los donantes (pacientes) se someterán a una leucaféresis. La leucaféresis es una técnica de separación específica en la que se recogen los componentes celulares de la sangre y, más concretamente, los leucocitos (glóbulos blancos). Estas células mononucleares de sangre periférica (PBMC) contienen los diferentes linfocitos (células T/células B/células NK) y monocitos (macrófagos, células dendríticas). Los contaminantes, como los glóbulos rojos y las plaquetas, pueden eliminarse mediante lavado10. El lavado y el enriquecimiento mononuclear (linfocitos y monocitos) se realiza utilizando dispositivos como el lavacélulas Lovo (Fresenius Kabi), el Terumo COBE 2991 (Terumo BCT) y el dispositivo Sepax (Sepax Technologies Inc.)10.
La condición médica del donante autólogo afectará al rendimiento y la pureza del producto CAR-T. Por lo tanto, los criterios de elegibilidad de los donantes deben establecerse antes de iniciar la terapia CAR-T y deben aplicarse los procedimientos y normas aplicables para limitar la variabilidad del material.
Paso 2: enriquecimiento y activación de células T
La figura 5 incluye un recuadro de color púrpura que muestra los pasos 2 a 5, ya que estos pasos deben cumplir con el requisito establecido en el Volumen 4 de EudraLex, Parte IV – Requisitos de las prácticas correctas de fabricación para los medicamentos de terapia avanzada11.
Tras la leucaféresis y el lavado, los subconjuntos de células T (CD4, CD8, CD25, etc.) se enriquecen utilizando la separación inmunomagnética en los dispositivos Miltenyi CliniMACs y Prodigy)10. Este paso se realiza seleccionando las células CD4+, CD8+, CD25+ mediante perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25. Estas células T procesadas pueden utilizarse directamente en otros procesos posteriores o criopreservarse para su uso posterior.
En el siguiente paso del proceso, se activan las células T, a lo que sigue la proliferación de las mismas mediante la adición de citoquinas específicas. La activación de las células T se obtiene simulando la unión simultánea in vivo del receptor de células T CD3 y del correceptor CD28 a su ligando, a saber, CD80/86 y MHC, que están representados in vitro por dos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a una perla inmunomagnética (Dynal Dynabeads: Human TActivator) o perlas Miltenyi (TransAct)10.
También se han descrito otros métodos de activación, por ejemplo, el uso de Expamer (marca registrada por Juno Therapeutics). Aquí, un oligómero soluble de la proteína StrepTactin forma la columna vertebral de los ligandos anti-CD3 y anti-CD2810.
Paso 3 – 4: Transducción y expansión
Actualmente, los dispositivos más utilizados son el G-Rex (Wilson Wolf Manufacturing), el Wave Bioreactor (GE Life Systems) y el CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec)10. Para la transducción de las células T, se utilizan principalmente vectores γ-retrovirales y vectores lentivirales que se añaden al vaso específico en el que se encuentran las células T. También se están investigando otros métodos no virales, como el sistema transposón/transposasa o la transferencia de ARNm mediante electroporación10.
Dado que estas células T se someten a una modificación genética, los productos de células CAR-T también deben cumplir los requisitos de los organismos modificados genéticamente (OMG). Esto puede suponer un gran reto, ya que las directivas de la UE sobre OMG se aplican e interpretan de forma diferente en los distintos Estados miembros europeos. Los obstáculos reglamentarios deben superarse a tiempo para obtener la aprobación de la ejecución de los ensayos clínicos y, en última instancia, la autorización de comercialización. Si tiene alguna duda, consulte a nuestro departamento de reglamentación.
Tras la transducción con éxito, las células CAR-T se expanden. El objetivo de este último paso es aumentar el número de células transducidas que expresan CAR y, en última instancia, obtener la cantidad deseada de células. Por ejemplo, los pacientes adultos jóvenes (de 50 kg o menos) con LLA de células B que reciben Kymriah necesitarán la siguiente dosis: de 0,2 a 5 x106 células T viables CAR/kg de peso corporal. El propio medicamento contendrá 1 o más bolsas de infusión, cada una de ellas con 1,2 x106 a 6 x108 células T viables CAR-positivas. Dado que se necesitan millones de células, el rendimiento es un factor muy importante a tener en cuenta para estos tratamientos autólogos.
Paso 5: Aislamiento del producto final
Después de la expansión, las células cosechadas se lavan y se centrifugan. Se añaden crioprotectores para la criopreservación del fármaco. El método más utilizado es la resuspensión en un medio de almacenamiento que contenga un 10% de dimetilsulfóxido, seguido del almacenamiento en nitrógeno líquido en fase de vapor 10.
Paso 6: Administración
Antes de poder administrar el producto al paciente mediante infusión, éste debe someterse a una terapia de acondicionamiento, es decir, a la linfodepleción mediante quimioterapia.
Desafíos de la terapia celular CAR-T
En esta entrada del blog se analizarán cuatro grandes retos. Para más información, consulte a los expertos en ATMP de QbD.
1. Obtener suficientes células
Los criterios de rendimiento pueden ser muy difíciles de obtener. Por lo tanto, la estrecha interacción con el proveedor de células (establecimiento de tejidos) y su cualificación son cruciales para comprender los riesgos de la variabilidad del material de partida y aplicar un enfoque basado en el riesgo para abordar estos problemas durante la fabricación. La elegibilidad del paciente y su estado de salud en el momento de la donación desempeñan un papel crucial.
2. Seguridad
Las terapias CAR-T, aunque son muy eficaces, también están asociadas a complicaciones de seguridad potencialmente graves. El personal médico debe estar capacitado para reconocer los síntomas y cómo manejarlos (estrategias de medicación).
- Toxicidad en la diana/ fuera del tumor: Si el antígeno objetivo también está presente en los tejidos normales, éstos también pueden convertirse en el objetivo y ser destruidos. Por lo tanto, es crucial seleccionar el antígeno candidato adecuado durante la I+D.
- Síndrome de liberación de citoquinas (CRS): El SRC está causado por la producción y liberación de grandes cantidades de citoquinas en la sangre procedentes de las células CAR-T activadas y de las células inmunitarias del huésped que interactuarán entre sí. Estas citocinas pueden provocar síntomas como fiebre, náuseas graves, hipotensión (presión arterial baja), hipoxia (bajo nivel de oxígeno en la sangre). El SRC grave puede provocar el deterioro de la función de los órganos o incluso la muerte.
- Síndromes de neurotoxicidad asociados a efectores inmunitarios (ICANS): Los ICAN se asocian a un aumento de los niveles de citoquinas en el líquido cefalorraquídeo debido a la alteración de la barrera hematoencefálica. Pueden aparecer síntomas como temblores, convulsiones, dificultad para escribir/hablar. Las afecciones graves pueden provocar un edema cerebral potencialmente mortal.
3. Marco normativo
Las diferencias en los requisitos normativos entre los estados miembros europeos (por ejemplo, las directivas sobre tejidos y las directivas sobre OGM transpuestas a la legislación nacional) y las diferencias entre las normativas europeas y estadounidenses de la FDA pueden ser un obstáculo importante para obtener la aprobación de los ensayos clínicos o la comercialización de los productos.
4. Comercialización
El proceso de fabricación, tal y como se visualiza en la figura 5, es complejo e implica una difícil gestión de la cadena de suministro (por ejemplo, la cadena de frío).
Dado que estas terapias se administran a pacientes recurrentes/refractarios y no en primera línea, el estado de salud del paciente (donante) suele ser muy grave. Por lo tanto, el tiempo entre vena y vena debe ser lo más corto posible para poder administrar el producto antes de que el paciente muera.
Como consecuencia de esta compleja cadena de fabricación/entrega y del hecho de que sólo se fabrica un lote de productos para un paciente, el coste de estas terapias es muy significativo. Para la comercialización, esto conlleva incertidumbres adicionales y desafíos de reembolso para que estos productos estén disponibles comercialmente para todos. Debe realizarse una evaluación de la tecnología sanitaria bien definida para evaluar los nuevos enfoques tecnológicos. Para más información, póngase en contacto con un representante de Health to Market
Perspectivas y retos futuros de la terapia celular CAR-T
Las terapias con células CAR-T han demostrado su enorme potencial en el tratamiento de las neoplasias de células B CD19. Sin embargo, la actividad antitumoral y el perfil de seguridad, la gama de tumores malignos (como los tumores sólidos) pueden mejorarse aún más. Se seguirán explorando nuevas estrategias para reducir los costes y la posibilidad de cambiar a productos alogénicos ya disponibles.
Algunos de los obstáculos que habrá que superar en un futuro próximo son el escape del antígeno, la falta de persistencia in vivo, los problemas de penetración en el tumor, el microambiente inmunosupresor, la toxicidad sistemática de las citoquinas, los efectos fuera del objetivo del tumor y la linfopenia, el tiempo de producción, los CAR-T fuera de especificaciones (OOS).
¿Necesita ayuda y asesoramiento?
- Reglamento (CE) nº 1394/2007 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 13 de noviembre de 2007, sobre medicamentos de terapia avanzada y por el que se modifican la Directiva 2001/83/CE y el Reglamento (CE) nº 726/2004 (Texto pertinente a efectos del EEE) DO L 324 de 10.12.2007, p. 121-137, CELEX: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/HTML/?uri=CELEX:32007R1394)
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